Was ist fluoreszieren?
Im Unterschied zur Absorption, die jede Substanz zeigt, ist schwierig vorauszusagen, welche Substanz fluoresziert. Tatsächlich sind die meisten Verbindungen nicht fluoreszierend. Ursache dafür ist der Umstand, dass ein Molekül im angeregten Zustand verschiedenen Prozessen ausgesetzt ist, die um die Anregungsenergie konkurrieren. Versetzt ein Photon ein Elektron des Moleküls in den angeregten Zustand S
, so beobachtet man Absorption von Licht. Das Elektron verweilt zumeist nur sehr kurze Zeit, etwa 10
s, in diesem Zustand und kehrt dann strahlungslos unter Abgabe der Energie als Wärme in den Grundzustand S0 zurück. Verweilt das Elektron jedoch länger, über 10
s, im angeregten Zustand, dann nimmt es zunächst das unterste Schwingungsniveau dieses Zustandes ein und verliert dadurch bereits einen Teil seiner Energie. Schließlich kehrt es unter Lichtemission in den Grundzustand zurück, das emittierte Licht ist nun energieärmer, also langwelliger, als das absorbierte. Die Entscheidung über den gewählten Weg, sofortige Rückkehr unter Energieverlust oder Emission, also Absorption oder Fluoreszenz, beruht auf der Konfiguration des jeweiligen Moleküls und ist aus der Strukturformel kaum erkennbar.
Fluoreszieren nutzen
Eine häufig zu beobachtende Eigenart fluoreszierender Verbindungen ist eine Verschiebung des Fluoreszenzmaximums zu niederen Wellenlängen in apolarer Umgebung, oft gepaart mit einer Intensitätserhöhung. Die Abhängigkeit vieler fluoreszierender Farbstoffe von der Polarität der Umgebung lässt sich für Proteinuntersuchungen wie für Bindungsmessungen ausnutzen. Künstliche Farbstoffe wie 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat (ANS, ANSA) emittieren im wässrigen Milieu nur sehr schwach, entwickeln aber eine starke Emission bei Wechselwirkung mit hydrophoben Regionen, wie Bindungszentren in Proteinen.
Fluoreszierende Verbindungen
Zu den natürlichen fluoreszierenden Verbindungen zählen die Flavinderivate wie FMN und FAD sowie die reduzierten Formen von NAD und NADP, worauf fluorimetrische Enzymtests basieren. Andere Nukleoside, wie die Pyrimidin- und Purinderivate zeigen keine oder allenfalls nur eine sehr schwache Fluoreszenz. Es ist eine große Palette künstlicher Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorophore) erhältlich, die entweder nicht kovalent mit Proteinen wechselwirken, oder, wie Fluoresceinisothiocyanat über reaktive Gruppen kovalent gebunden werden.
Auszug aus: Hans Bisswanger, Enzyme: Struktur, Kinetik, Anwendungen, ISBN 978-3-527-33675-3
